AH109  Chemically Competent Cell  酵母感受態(tài)細(xì)胞

基因型：

MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ,gal80Δ,LYS2 : : GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, MEL1 GAL2UASGAL2TATA-ADE2, URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lac

簡要說明：

AH109菌株來源于PJ69-2A 酵母菌株，將lacZ報(bào)告基因引入PJ69-2A誕生了AH109，此菌株是Clontech公司開發(fā)的GAL4系統(tǒng)酵母雙雜實(shí)驗(yàn)用菌株，MATa型，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒或與MATα型酵母菌株Y187通過mating操作進(jìn)行蛋白互作驗(yàn)證或篩庫試驗(yàn)。Transformation marker為: trp1, leu2，報(bào)告基因?yàn)椋簂acZ,HIS3, ADE2, MEL1。AH109 -GAL4酵母雙雜系統(tǒng)需要兩種質(zhì)粒配套使用：PGBKT7和PGADT7。質(zhì)粒PGBKT7的篩選標(biāo)志為TRP1，用于表達(dá)DNA-BD(來自酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4N端1~ 174位氨基酸)與目標(biāo)蛋白(Bait)的融合蛋白；質(zhì)粒PGADT7的篩選標(biāo)志為LEU，用于表達(dá)AD(GAL4 C端768 ~881 位氨基酸)與目標(biāo)蛋白（Prey）的融合蛋白。GAL4系統(tǒng)原理：一個(gè)完整的酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4可分為功能上相互獨(dú)立的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：位于N端1 ~ 174位氨基酸區(qū)段的DNA結(jié)合域（DNA-BD）和位于C端768 ~881 位氨基酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活域(AD)。DNA-BD能夠識別GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并與之結(jié)合。而AD可以啟動UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。BD和AD單獨(dú)存在不能激活轉(zhuǎn)錄，但當(dāng)二者接近時(shí)，則呈現(xiàn)完整的GAL4活性，使含有UAS的啟動子下游基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。正常條件下，BD不與AD結(jié)合，將要檢測的蛋白質(zhì)分別與BD和AD融合，形成 bait 融合蛋白（bait -BD）和 prey 融合蛋白（prey-AD），如果 bait 和 prey發(fā)生相互作用，就會促使 BD 和 AD 的相互接近，形成完整的GAL4，從而激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。AH109有四個(gè)報(bào)告基因：lacZ, HIS3, ADE2, MEL1，分別由三種不同的啟動子（GAL1，GAL2，MEL1）啟動，這三種啟動子只有GAL4識別的17bp核心區(qū)相同，其余部分均不同，大大降低了酵母雙雜假陽性發(fā)生的概率。 High5TM系列AH109感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，經(jīng)PGADT7質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>104cfu/μg DNA 。

操作說明：

1. 取pBait-AbAi質(zhì)粒5µg，BstBI或 BbsI酶切1h，回收；

2. 取一支無菌的1.5ml EP管，依次加入預(yù)冷的預(yù)冷的線性pBait-AbAi質(zhì)粒1-5 µg（體積不高于15 µl），Carrier DNA(95-100 度5min 快速冰浴，重復(fù)一次)10µl，100µl冰上融化的Y1HGold感受態(tài)細(xì)胞，PEG/LiAc 500µl，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻6-8次；

3. 30℃水浴30min，每10min輕輕翻轉(zhuǎn)混勻6-8次；

4. 每支加入20µl的二甲基亞砜（用以提高轉(zhuǎn)化效率，可不做）；

5. 42℃水浴15min，每5min輕輕翻轉(zhuǎn)混勻6-8次；

6. 12000rpm瞬時(shí)離心棄上清，每支加入1ml的YPD Plus（YPDA）于30℃復(fù)蘇1h（用以提高轉(zhuǎn)化效率，可不做）；

7. 12000rpm瞬時(shí)離心棄上清，用100µl 0.9% NaCl重懸，涂板，30℃培養(yǎng)48-96h。

注意事項(xiàng)：

1.PEG在低溫下易析出，請?jiān)诔叵聎an全溶解后使用。

2.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。

3.同時(shí)轉(zhuǎn)化2-3種質(zhì)粒時(shí)可增加質(zhì)粒的用量。

4.Y1HGold酵母菌株對高溫敏感，最適生長溫度為27-30℃；高于31℃，生長速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。

5.菌落變粉不是污染，是酵母細(xì)胞生長中一個(gè)常見現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞在平板培養(yǎng)幾天后，平板上的Adenine被酵母消耗完畢，酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用，然而，Y1HGold的ADE2基因被破壞，Adenine合成途徑受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中間產(chǎn)物P-ribosylaminoimidazole（AIR）在細(xì)胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色。

6.酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長速度比YPDA培養(yǎng)基慢，培養(yǎng)基中缺陷成分越多，生長越慢，以轉(zhuǎn)化涂板為例：涂YPDA平板29℃，48h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆；涂SD單缺平板29℃，48-60h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60-80h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆。