Chemically 酵母感受態細胞

Y1HGold Chemically Competent Cell  酵母感受態細胞

基因型：

MATα, ura3-52, his3-200, ade2-101, trp1-901, leu2-3,112, gal4Δ, gal80Δ, met–, MEL1

簡要說明：

Y1HGold菌株是GAL4-AbA酵母單雜系統用菌株，MATα型，可直接轉化質粒進行篩庫試驗。Transformation marker為：ura3，leu2；報告基因為：AbAr。Y1HGold-GAL4-AbA 酵母單雜系統需要兩種質粒配套使用：pAbAi 和PGADT7。質粒pAbAi的篩選標志為URA，用于表達pBait-AbAi construct (1~3個bait DNA序列重復串聯后克隆到pAbAi中)；質粒pGADT7的篩選標志為LEU，用于表達AD(GAL4 C端768~881位氨基酸)與目標蛋白 (Prey)的融合蛋白。此外AbAr與營養缺陷報告基因相比具有更低背景的優點，可降低酵母單雜假陽性發生的概率。Y1HGold感受態細胞經特殊工藝制作，pGADT7質粒檢測轉化效率>104 cfu/μg DNA。

操作說明：

1. 取pBait-AbAi質粒5µg，BstBI或 BbsI酶切1h，回收； 

2. 取一支無菌的1.5ml EP管，依次加入預冷的預冷的線性pBait-AbAi質粒1-5 µg（體積不高于15 µl），Carrier DNA(95-100 度5min 快速冰浴，重復一次)10µl，100µl冰上融化的Y1HGold感受態細胞，PEG/LiAc 500µl，輕輕翻轉混勻6-8次； 

3. 30℃水浴30min，每10min輕輕翻轉混勻6-8次； 

4. 每支加入20µl的二甲基亞砜（用以提高轉化效率，可不做）； 

5. 42℃水浴15min，每5min輕輕翻轉混勻6-8次； 

6. 12000rpm瞬時離心棄上清，每支加入1ml的YPD Plus（YPDA）于30℃復蘇1h（用以提高轉化效率，可不做）； 

7. 12000rpm瞬時離心棄上清，用100µl 0.9% NaCl重懸，涂板，30℃培養48-96h。

注意事項：

1.PEG在低溫下易析出，請在常溫下wan全溶解后使用。 

2.轉化高濃度的質粒可相應減少最終用于涂板的菌量。

 3.同時轉化2-3種質粒時可增加質粒的用量。 

4.Y1HGold酵母菌株對高溫敏感，最適生長溫度為27-30℃；高于31℃，生長速度和轉化效率呈指數下降。 

5.菌落變粉不是污染，是酵母細胞生長中一個常見現象。當細胞在平板培養幾天后，平板上的Adenine被酵母消耗完畢，酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用，然而，Y1HGold的ADE2基因被破壞，Adenine合成途徑受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中間產物P-ribosylaminoimidazole（AIR）在細胞中積累而使菌落變為粉紅色。 

6.酵母在缺陷培養基中生長速度比YPDA培養基慢，培養基中缺陷成分越多，生長越慢，以轉化涂板為例：涂YPDA平板29℃，48h培養可見直徑1mm克隆；涂SD單缺平板29℃，48-60h培養可見直徑1mm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60-80h培養可見直徑1mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培養可見直徑1mm克隆。