Chemically Competent Cell克隆感受態(tài)細胞

BJ5183 Chemically Competent Cell

基因型：

endA1 sbcBC recBC galK met thi-1 bioT hsdR (StrR)

簡要說明：

BJ5183是一種具有較高重組活力的大腸桿菌菌株，是目前腺病毒系統(tǒng)常用的感受態(tài)細胞。BJ5183菌株含有sbcBC recBC雙重突變，賦予BJ5183細胞較強的重組能力，有利于轉(zhuǎn)入的目的基因與腺病毒質(zhì)粒{pAdeasy-1[encodes the Adenovirus-5genome (E1/E3 deleted)]或pAdeasy-2[encodes theAdenovirus-5 genome (E1/E3/E4 deleted)]}的重組。endA1（缺失核酸內(nèi)切酶）的突變有利于重組DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取。StrR賦予BJ5183菌株lian霉素抗性。BJ5183感受態(tài)細胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>5×108 cfu/μgDNA。

操作說明：

1.BJ5183感受態(tài)細胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，待菌塊融化，加入目的質(zhì)粒（含有目標(biāo)基因并線性化）和腺病毒質(zhì)粒，并用手bo打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。 

2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰中并靜置2分鐘，晃動會降低轉(zhuǎn)化效率。 

3.向離心管中加入700 μl不含抗生素的2YT或LB無菌培養(yǎng)基，混勻后37℃，200 rpm復(fù)蘇60分鐘。 

4.5000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。 

5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

注意事項：

1.感受態(tài)細胞最好在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA，不可在冰中放置時間過長，長時間存放會降低轉(zhuǎn)化效率。 

2.混入目的DNA時應(yīng)輕柔操作。 

3.BJ5183菌株的質(zhì)粒產(chǎn)量不高。腺病毒構(gòu)建成功后，可選擇在其他大腸桿菌菌株中擴繁，純化質(zhì)粒。 

4.BJ5183感受態(tài)細胞對溫度敏感，應(yīng)儲存在-80℃超低溫冰箱，避免溫度波動，溫度波動會降低感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率。