Chemically Competent Cell克隆感受態細胞

DH10Bac Chemically Competent Cell

基因型：

F- mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80lacZM15 lacX74 recA1 endA1araD139 ?(ara,leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG/pMON14272 / pMON7124

簡要說明：

DH10Bac感受態主要用于生產重組桿狀病毒分子（Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統）。DH10Bac菌株中含有父本桿粒bMON14272、輔助質粒pMON7124：父本桿粒 bMON14272包含mini-F復制子,卡那抗性基因, attTn7位點和lacZα互補因子；輔助質粒pMON7124含有tnsABCD區（tnsABCD region supplies thetransposition proteins required for insertion of themini-Tn7 from the donor plasmid into its target site onthe parent bacmid），具有四環素抗性，在細胞擴增過程中丟失，但可提高供體質粒pFastBac轉化后的基因轉座效率。mcrA、mcrBC及mrr突變使DH10Bac菌株適合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA（Therefore , genomic DNA ,both prokaryotic and eukaryotic, can be clonedefficiently in DH10Bac）。recA1和endA1的突變有利于插入DNA的穩定和高純度質粒DNA的提取。φ80dlacZ?M15的存在使DH10Bac可用于藍白斑篩選，High5TM系列DH10Bac感受態細胞經特殊工藝制作，經pUC19質粒檢測轉化效率>108cfu/μg。

操作說明：

1.DH10Bac感受態細胞放置冰中融化（或放手心或室溫片刻，待菌體處于冰水混合狀態時迅速插入冰中），加入目的DNA（質粒或連接產物）并用手打EP管底輕輕混勻，冰上靜置25分鐘。 

2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動會降低轉化效率。 

3.向離心管中加入900μl不含抗生素的SOC無菌培養液，混勻后37℃，225 rpm復蘇4小時。4.復蘇完成后，用S.O.C.稀釋轉化液到（10-1，10-2），每個稀釋用吸取100ul鋪一個LB平板（共涂3個平板），平板包含50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，10ug/ml tetracycline，40ug/ml X-gal，40ug/ml IPTG。5.將平板倒置放于37℃培養箱48h。

 陽性驗證： 

1.挑10個白色的克隆，重新劃線在LB平板（50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，10ug/ml tetracycline，40ug/ml X-gal，40ug/ml IPTG）。37度過夜培養。 

2.挑選白色的克隆，轉接到含有50ug/ml Kan，7ug/mlGentamicin，7ug/ml tetracycline的LB培養液中，過夜培養。 

3.使用試劑盒抽提重組質粒DNA（＞100kb）。使用PCR法分析重組質粒是否正確重組。

注意事項：

1. 感受態細胞最好在冰上融化。 

2.混入質粒或連接產物時應輕柔操作。 

3.轉化高濃度的質粒或高效率的連接產物可相應減少最終用于涂板的菌量。 

4. 涂板時務必涂干，平板表面不留任何水漬。