Chemically Competent Cell克隆感受態(tài)細(xì)胞

Chemically Competent Cell克隆感受態(tài)細(xì)胞     Mach1-T1 Chemically Competent Cell 

基因型：

F- φ80(lacZ)ΔM15 ΔlacX74 hsdR(rK- mK+) ΔrecA1398endA1 tonA

簡(jiǎn)要說(shuō)明：

Mach1-T1 菌株由野生型 non-K-12 E. Coli W 菌株改造而來(lái)，是目前生長(zhǎng)速度較快的感受態(tài)細(xì)胞之一，在平板上 9 h 可見(jiàn)克隆，缺失核酸內(nèi)切酶 (endA)，提高了質(zhì)粒 DNA 的產(chǎn)量和質(zhì)量；重組酶缺陷型 (recA1398)減少插入片段的同源重組概率，保證了插入 DNA 的穩(wěn)定性；lacZ M15 的存在使 Mach1-T1 可用于藍(lán)、白斑篩選；tonA 突變賦予 Mach1-T1 菌株對(duì)噬菌體T1 和 T5 的抗性。Mach1-T1 感受態(tài)細(xì)胞 經(jīng)特殊工藝制作，pUC19 質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>5x108 cfu/μg DNA

操作說(shuō)明：

1.Mach1-T1 感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，待菌塊融化，加入目的 DNA（質(zhì)粒或連接 產(chǎn)物）并用手打 EP 管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置 25 分鐘。

2.42℃水浴熱激 45 秒，迅速放回冰上并靜置 2 分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

3.向離心管中加入 700 μl 不含抗生素的無(wú)菌2YT 或 LB培養(yǎng)基，混勻后 37℃，200 rpm 復(fù)蘇 60 分鐘。

4.5000 rpm 離心一分鐘收菌，留取 100 μl 左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的 2YT 或 LB 培養(yǎng)基上。

5.將平板倒置放于 37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。如果進(jìn)行藍(lán)白斑篩選操作，將平板放 37℃培養(yǎng)至少 13 h。

注意事項(xiàng)：

1.感受態(tài)細(xì)胞最好在冰中緩慢融化。插入冰中 8 分鐘內(nèi)加入目標(biāo) DNA，不可在冰中放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間 存放會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

2.混入目的 DNA 時(shí)應(yīng)輕柔操作。

3.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒或高效率的連接產(chǎn)物可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。