Chemically 酵母感受態細胞

EGY48 Chemically Competent Cell  酵母感受態細胞

基因型：

MATα, ura3, his3, trp1, LexAop (x6)-LEU2

簡要說明：

EGY48菌株是LexA系統酵母雙雜實驗用菌株，MATα型，可直接轉化質粒驗證蛋白互作或篩庫；Transformation marker為：his3，trp1,ura3，報告基因為：LEU2；報告基因UAS (上游激活序列)來源于LexA op(x6)，只有當Bait和Prey互作時才能啟動LEU2表達。EGY48-LexA系統有三種配套質粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ。質粒pLexA篩選標志為HIS3，用于表達DNA-BD與目標蛋白(Bait)的融合蛋白；質粒pB42AD篩選標志為TRP1，用于表達AD與目標蛋白(Prey)的融合蛋白；報告質粒p8op-LacZ篩選標志為URA3，報告基因為LacZ，報告基因UAS來源于LexAop(x6)，只有當Bait和Prey互作時才能啟動LacZ表達。EGY48感受態細胞經特殊工藝制作，pGBKT7質粒檢測轉化效率>104 cfu/μg DNA

操作說明：

1. 取pBait-AbAi質粒5µg，BstBI或 BbsI酶切1h，回收；

2. 取一支無菌的1.5ml EP管，依次加入預冷的預冷的線性pBait-AbAi質粒1-5 µg（體積不高于15 µl），Carrier DNA(95-100 度5min 快速冰浴，重復一次)10µl，100µl冰上融化的Y1HGold感受態細胞，PEG/LiAc 500µl，輕輕翻轉混勻6-8次；

3. 30℃水浴30min，每10min輕輕翻轉混勻6-8次；

4. 每支加入20µl的二甲基亞砜（用以提高轉化效率，可不做）；

5. 42℃水浴15min，每5min輕輕翻轉混勻6-8次；

6. 12000rpm瞬時離心棄上清，每支加入1ml的YPD Plus（YPDA）于30℃復蘇1h（用以提高轉化效率，可不做）；

7. 12000rpm瞬時離心棄上清，用100µl 0.9% NaCl重懸，涂板，30℃培養48-96h。

注意事項：

1.PEG在低溫下易析出，請在常溫下wan全溶解后使用。

2.轉化高濃度的質粒可相應減少最終用于涂板的菌量。

3.同時轉化2-3種質粒時可增加質粒的用量。

4.Y1HGold酵母菌株對高溫敏感，最適生長溫度為27-30℃；高于31℃，生長速度和轉化效率呈指數下降。

5.菌落變粉不是污染，是酵母細胞生長中一個常見現象。當細胞在平板培養幾天后，平板上的Adenine被酵母消耗完畢，酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用，然而，Y1HGold的ADE2基因被破壞，Adenine合成途徑受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中間產物P-ribosylaminoimidazole（AIR）在細胞中積累而使菌落變為粉紅色。

6.酵母在缺陷培養基中生長速度比YPDA培養基慢，培養基中缺陷成分越多，生長越慢，以轉化涂板為例：涂YPDA平板29℃，48h培養可見直徑1mm克隆；涂SD單缺平板29℃，48-60h培養可見直徑1mm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60-80h培養可見直徑1mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培養可見直徑1mm克隆。