Chemically Competent Cell克隆感受態細胞

GT115 Chemically Competent Cell

基因型：

F- mcrA?(mrr-hsdRMS-mcrBC) f80lacZDM15?lacX74 recA1rpsL (StrR) endA1 ?dcm uidA(DMluI)::pir-116?sbcC-sbcD

簡要說明：

GT115菌株，是專門用來克隆含有發夾結構（Hairpin）或重復序列等DNA二級結構的基因序列的大腸桿菌菌株。大腸桿菌中存在一種SbcCD蛋白復合體，可以識別DNA發夾結構，并將其切除；將sbcC和sbcD兩個基因突變，增強了發夾結構DNA的穩定性。同時在大腸桿菌基因組中引入uidA(DMluI)::pir-116，使GT115可以表達 兀 蛋白，含有R6Kgori復制子的質粒( pCpG-mcs、pCpG-LacZ、pCpG-siRNA …)可以正常復制。rpsL賦予GT115lian霉素抗性，同時該菌株還含有核酸酶 (endA)突變、重組酶 (recA)突變，增強了外源DNA的穩定性。GT115感受態細胞經特殊工藝制作，pUC19質粒檢測轉化效率可達1×108 cfu/μg DNA。

操作說明：

1. 感受態細胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，待菌塊融化，加入目的 DNA（質粒或連接產物） 并用手bo打 EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25 分鐘。

2. 42℃水浴熱激 45秒，迅速放回冰上并靜置 2分鐘，晃動會降低轉化效率。

3. 向離心管中加入700 μl不含抗生素的無菌SOC 或LB培養基，混勻后 37℃，200 rpm復蘇 60分鐘。 

4. 5000 rpm離心一分鐘收菌，留取 100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應抗生素的 SOC 或 LB培養基上。

5. 將平板倒置放于37℃培養 6.5 小時以上

注意事項：

1. 感受態細胞最好在冰中緩慢融化。插入冰中8 分鐘內加入目標DNA，不可在冰中放置時間過長，長時間存放會降低轉化效率。

2. 混入目的 DNA 時應輕柔操作。 

3. 轉化高濃度的質粒或高效率的連接產物可相應減少最終用于涂板的菌量。