酵母感受態細胞的操作說明及注意事項

操作說明：

1、取一支無菌的1.5mlEP管，依次加入預冷的目的質粒1-3µg，Carrier DNA 10µl(95-100 度5min 快速冰浴，重復一次)，100µl冰上融化的AH109感受態細胞，PEG/LiAc500µl，輕輕翻轉混勻6-8次； 

2、30℃水浴30min，每10min輕輕翻轉混勻6-8次；

3、每支加入20µl的二甲基亞砜；（用于提高轉化效率，可不做）

4、42℃水浴15min，每5min輕輕翻轉混勻6-8次；

5、12000rpm瞬時離心棄上清，每支加入1ml的YPDPlus于30℃復蘇1h；（用于提高轉化效率，可不做）

6、12000rpm瞬時離心棄上清，用100µl0.9%NaCl重懸，涂板，30℃培養48-96h。

注意事項：

1、感受態細胞最好在冰上融化。

2、若使用pYES2質粒表達蛋白，需在培養基中加入2%的半乳糖（篩選培養基中不用加半乳糖；當需要目的蛋白表達時，需加入半乳糖代替葡萄糖作為碳源），以誘導目的基因的表達。

3、轉化高濃度的質粒可相應減少最終用于涂板的菌量。

4、同時轉化2-3種質粒時可增加質粒的用量。

5、酵母為真核生物，不易長期保存，隨感受態在-80℃保存時間的延長，轉化效率會不斷下降，建議保存時間不超過90天。

6、BY4742酵母菌株對高溫敏感，適生長溫度為27-30℃；高于31℃，生長速度和轉化效率呈指數下降。

7、酵母在缺陷培養基中生長速度比YPDA培養基慢，培養基中缺陷成分越多，生長越慢，以轉化涂板為例：涂YPDA平板29℃，48h培養可見直徑1mm克隆；涂SD單缺平板29℃，48-60h培養可見直徑1mm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60-80h培養可見直徑1mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培養可見直徑1mm克隆。